FlowJo(细胞分析专业软件)

FlowJo是一款流式细胞分析专业软件，可以兼容几乎所有流式仪器采集的数据，FlowJo简单易用，功能强大，帮助用户轻松了解了解细胞的状态变化拥有流动室和液流驱动系统，光电转换器和数据处理系统等先进的科学技术。

FlowJo是一款流式细胞分析专业软件，可以兼容几乎所有流式仪器采集的数据，FlowJo简单易用，功能强大，帮助用户轻松了解了解细胞的状态变化, 拥有流动室和液流驱动系统，光电转换器和数据处理系统等先进的科学技术！

功能介绍

　　1.单标样本

　　单标记样本数据常用的显示方式是单参数直方图。通常横坐标可以是线性标度或对数标度，代表着所检测的荧光或散射光的强度；纵坐标表示的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对百分比来表现。

　　以3 color comp 文件夹中的CyPE comp.fcs进行分析演示。将此文件夹移至桌面，并把该数据文件夹从桌面拖入Flowjo中的组空间中。

　　在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的所有样本。而后在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。

　　此为二维点图，X轴选择SSC（侧向散射，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，SSC越大，反之越小。）Y轴选择FSC（前向散射，细胞越大，FSC越大；反之越小。）

　　选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中的任意一个，在二维点图中选中淋巴细胞。

　　在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一个，在单参数直方图中设门。

　　2.多色标样本

　　多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。

　　以三标记样本为例，选择3-color-experiment文件夹中的931115-B02-Sample01.FCS进行分析演示。同样，在在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具，在二维点图中选中淋巴细胞。

　　双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor::CD3，Y轴选择FSC。使用矩形设门工具选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞。

　　双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择Cy5PE::CD4，Y轴选择PhyEry::CD8，使用十字门工具设门（拖动鼠标将四分门移到目标位置即可，一般根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处），如下图所示：

　　Q1：CD8单阳性细胞，为CD8+ T细胞

　　Q2：双阳性细胞

　　Q3：CD4单阳性细胞，为CD4+ T细胞

　　Q4：双阴性细胞

　　3.细胞凋亡（Cell apoptosis）

　　拖入凋亡样本，双击原始数据打开图形窗口。X轴选择FSC-A，Y轴选择SSC-A。分析凋亡的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。细胞碎片不予分析。

　　在SSC/FSC图中双击“分析的细胞群体”，X轴选择FITC,用来表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas,用来表示PI。用四分门设门工具界定活细胞和凋亡细胞。如下图所示：

　　Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。

　　Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。

　　Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

　　Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

　　通常统计细胞凋亡率时采用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV阳性群）。

　　4.细胞周期（Cell Cycle）

　　细胞周期的检测是流式细胞仪最为广泛的应用之一。细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。通常由G1期、S期、G2期和M期组成。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完成染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查和修复，以保证DNA复制的准确性。在M期完成遗传到子细胞中的均等分配，使细胞进行分裂。

　　细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

　　以cell cycle 文件夹中的5206.001，PI标记为例，设门选取目标细胞群体，将细胞碎片排除在外。即双击工作台中的5206.001样本，打开图形窗口。X轴选择FSC-H，Y轴选择SSC-H，细胞碎片位于左下角的位置，设门选中目标细胞，如下图：

　　设门选中要进行细胞周期分析的单细胞群体，排除粘连细胞（粘连在一起的双细胞或多细胞团块等）的影响。X轴选择FL2-W(width)，Y轴选择FL2-A(area)，设门方式如下图：

　　BD的流式仪采集的数据：在进行周期分析的时候，通常是采用FL2-A与FL2-W（或者FL2-A与FL2H）进行设门。

　　Beckman的流式仪采集的数据：X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。设门方式如下图：

　　在FlowJo工作台中选中“单细胞群体”这个节点，在菜单栏的“工具”中选择“细胞周期”，打开周期分析窗口。得到G1期、S期、G2期细胞百分比，G1期CV值和G2期CV值等数据。

　　图中粉色的曲线是周期拟合的模型曲线，黑色的为样本曲线。理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。拟合的好坏可以根据右边的RMS值来判断。RMS(root mean square error)值越小越好，当周期拟合的不好的时候，可以通过更换拟合模型（Watson和Dean-Jett-Fox）或者更改限制条件确保（G1是G2的两倍）进行调整。

　　而G1/S/G2百分比：G1/S/G2期细胞所占的百分比。G1/G2均数：G1/G2期细胞荧光强度的平均数。CV（Coefficient of Variation，变异系数）：仪器因素和样品制备及染色过程对标本的人为影响。通常G0/G1峰的CV来检测分辨率或精度。G1 cv/G2 cv：G1/G2峰的变异系数，其大小反映了G1/G2峰的宽度，数值越小，峰越窄。

　　FlowJo 处理流式数据简单易学，而且TOP10 免疫学期刊上的文章大多数都是用 FlowJo 分析数据。使用好FlowJo对发高分文章会有很大的帮助。